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  • 您的位置:在点网 > 教案 > 生物教案 > 微生物的分离和培养教案 正文 2016-09-13

    微生物的分离和培养教案

    相关热词搜索:微生物 教案 分离 培养 微生物的实验室培养ppt 微生物的分离和培养 分离纯化微生物的步骤

    篇一:微生物的分离与培养

    病原物的分离与培养

    病原物的分离与培养在植物病害的研究中具有重要意义,分离、培养病原菌的方法是植物病理学研究工作中最常应用的实验技术。一方面,在一个新的病害研究中,通过分离与培养获得病原物的纯培养,完成柯氏法则,以明确该病病原;研究病原物的生物学特性和病害循环(侵染、病程等等)。所谓病原物的分离,即把该病原菌从发病组织上与其他微生物分开;所谓病原物的培养,即将分离的病原菌移到可以让这种病原菌正常生长的营养基质即培养基上,从而获得其纯培养。病原物的分离与培养,需经以以几个步骤:

    1.有关器皿的灭菌和消毒;

    2.制作培养基;

    3.病原菌的分离

    4.病原菌的培养。

    -、灭菌与消毒

    灭菌与消毒是两个不同的概念。灭菌则是指杀死一切微生物的营养体和孢子。消毒一般是指消灭病原菌和有害微生物的营养体,在植物病理学实验中,需要进行纯培养,不能有任何杂菌污染,因此对所用器材、培养基和工作场所都要进行严格的消毒和灭菌。消毒与灭菌的方法很多,一般可分为加热、过滤、辐射和使用化学药品等方法。

    (一) 热力灭菌 热力灭菌分干热灭菌和湿热灭菌两类。

    1.干热灭菌 干热灭菌是利用高温使微生物细胞内的蛋白质凝固变性而达到灭菌的目的。细胞内的蛋白质疑固性与其本身的含水量有关。在菌体受热时,当环境和细胞内含水量越大,则蛋白质凝固就越快,反之含水量越小,凝固越慢。因此,与湿热灭菌相比,干热灭菌所需温度高(160~170℃),时间长1~2 h。但干热灭菌温度不能超过180 ℃,否则包器皿的纸或棉塞就会烧焦,甚至引起燃烧。干热灭菌使用的仪器是烘箱。

    干热灭菌有火焰烧灼灭菌和热空气灭菌两种。火焰烧灼灭菌适用于接种环、接种针和金属用具如镊子等,无菌操作时酌试管口和瓶口也在火焰上作短暂烧灼灭菌。涂布平板用的三角玻棒也可在蘸有乙醇后进行灼烧灭菌。通常所说的干热灭菌是在烘箱内利用高温干燥空气(160~170℃)进行灭菌。此法适用于玻璃器皿如吸管和培养皿等的灭菌。

    进行干热灭菌要注意以下问题:物品不要摆得太挤,以免妨碍空气流通;灭菌物品不要接触烘箱内壁的铁板,以防包装纸烤焦起火;

    在升温过程中,如果红灯熄灭,绿灯亮,表示箱内停止加温;电烘箱内温度未降到70℃以前,切勿自行打开箱门以免骤然降温导致玻璃器皿炸裂。

    2 湿热灭菌

    (1) 高压蒸汽灭菌 此法是将物品放在密闭的高压蒸汽灭菌锅内,0.1MPa,121℃保持15~30 min进行灭菌。时间的长短可根据灭菌物品种类和数量的不同而有所变化,以达到彻底灭菌。这种灭菌适用于培养基、工作服、橡皮物品等,也可用于玻璃器皿的灭菌。

    (2) 常压蒸汽灭菌 在不具备高压蒸汽灭菌的情况下:常压蒸汽灭菌是一种常用的灭菌法。对于不宜用高压蒸汽灭菌的培养基如明胶培养基、牛乳培养基、含糖培养基等可采用常压蒸汽灭菌。这种灭菌方法可用阿诺氏流动蒸汽灭菌器进行,也可用普通蒸笼进行灭菌。由于常压,其温度不超过100℃,仅能使大多数微生物被杀死,而芽孢细菌却不能在短时间内杀死,因此可采用间歇灭菌以杀死芽孢细菌,达到彻底灭菌的目的。

    常压间歇灭菌是将灭菌培养基放人灭菌器内,每天加热100℃,30 min,连续3 d,第一天加热后,其中的营养体被杀死,将培养物取出放室温下18~24 h,使其中的芽孢发育成营养体,第二天再加热100℃,30 min,发育的营养体又被杀死,但可能仍留有芽孢,故再重复一次,使彻底灭菌。

    (二) 过滤除菌

    许多材料例如血清、抗生素及糖溶液等用加热消毒灭菌方法,—均会被热破坏,因此采用过滤除菌的方法。应用最广泛的过滤器有:

    (1) 蔡氏过滤器 该过滤器是由石棉制成的圆形滤板和一个特制的金属(银或铝)漏斗组成,分上、下两节。过滤时,用螺旋把石棉板紧紧夹在上、下两节滤器之间,然后将溶液臵于滤器中抽滤。每次过滤必须用一张新滤板。根据其孔径大小,滤板分为3种型号:K型最大,作一般澄清用;EK滤孔较小,用来除去一般细菌;EK-S滤孔最小,可阻止大病毒通过。使用时可根据需要选用。

    (2) 微孔滤膜过滤器 这是一种新型滤器,其滤膜是用醋酸纤维酯和硝酸纤维酯的混合物制成的薄膜。微孔滤膜过滤器是由上下二个分别具有出口和入口连接装臵的塑料盖盒组成。出口处可连接针头,入口处可连接针筒。使用时将滤膜装入两塑料盖盒之间,旋紧盖盒,当溶液从针筒注入滤器时,此滤器将各种微生物阻留在微孔滤膜上面,从而达到除菌的目的。根据待除菌溶液量的多少,可选用不同大小的滤器。此法除菌的最大优点是可以不破坏溶液中各种物质的化学成分。但由于滤量有限,所以一般只适用于实验室中小量溶液的过滤除菌。实验室中用于除菌的微孔滤膜孔径一般为0.22μm,但若要将

    病毒除掉,则需更小孔径的微孔滤膜。微孔滤膜过滤除菌的主要操作步骤为:

    ① 组装、灭菌 将0.22μm孔径的滤膜装入清洗干净的塑料滤器中,旋紧。压平,包装灭菌后待用(0.1MPa、121.5℃灭菌:20 min)。连接。将灭菌滤器的入口在无菌条件下,以无菌操作方式连接于装有待滤溶液注射器上,将针头与出口处连接并插入带橡皮塞的无菌试管中。

    ② 压滤 将注射器中的待滤溶液加压缓缓挤压过滤到无菌试管中。滤毕,将针头拨出。压滤时,用力要适当,不可太猛太快,以免细菌被挤压通过滤膜。

    提示: 整个过程应在无菌条件下严格无菌操作以防污染,过滤时应避免各连接处出现渗透现象。

    (三) 辐射灭菌 紫外线灭菌是用紫外线灯进行的。波长为200~300 nm的紫外线都有杀菌能力,其中以260 nm的杀菌力最强。在波长一定的条件下,紫外线的杀菌效率与强度和时间的乘积成正比。紫外线杀菌机理主要是因为它诱导了胸腺嘧啶二聚体的形成和DNA的交联,从而抑制了DNA的复制。另一方面,由于辐射能使空气中的氧电离成[O],再使O2氧化生成臭氧(O3),或使水氧化生成过氧化氢

    (H2O2)。O3和H2O2有杀菌作用。紫外线穿透力不大,所以只适用于无

    菌室、接种箱的空气及物体表面的灭菌。

    注意事项: 紫外线对眼结膜及视神经有损伤作用,对皮肤有刺激作用,故不能直视紫外线灯光,更不能在紫外线灯光下工作。紫外线灯距照射物以不超过1.2 m为宜。

    此外,采用60Co-γ射线灭菌,也已广泛用于不能进行加热灭菌的纸、塑料薄膜,各种积层材料制作的容器以及医用生物敷料皮等的灭菌。γ射线灭菌的最大优点是穿透力强,可在厚包装完好条件下灭菌。

    (四) 化学药品灭菌

    化学药品消毒灭菌法是应用能抑制或杀死微生物的化学制剂进行消毒灭菌的方法。能破坏细菌代谢机能并有致死作用的化学药剂为杀菌剂,如重金属离子等;只是阻抑细菌代谢机能,使细菌不能增殖的化学药剂为抑菌剂,如磺胺类及大多数抗生素等。化学药品对微生物的作用是抑菌还是杀菌以及作用效果还与化学药品浓度的高低、处理微生物的时间长短、微生物的种类以及微生物所处的环境等有关。

    植物病理学实验室中常用的化学药品有2%煤酚皂溶液(来苏尔)、0.25%新洁尔灭、0.1%升汞、3%~5%酌甲醛溶液、75%乙醇溶液等。

    消毒与灭菌不仅是从事植物病理学和整个生命科学研究必不可少的重要环节和实用技术,而且在医疗卫生、环境保护、食品、生物

    制品等各方面均具有重要的应用价值。根据不同的使用要求和条件选用合适的消毒灭菌的方法。

    二、培养基的制作

    1、目的要求

    了解培养基的配制原理,掌握培养基的制备方法。

    2、基本原理

    在植物病理学研究工作中经常要使用各种不同的培养基。培养基是按照生物生长繁殖所需要的各种营养,用人工方法配制而成的营养基质。其中含有碳源、氮源、无机盐、维生素以及水分等。微生物在培养基上生长繁殖还必须在最适pH范围内才能生长得更好,因此,对不同种类的微生物应将培养基调节到一定的pH范围。-般而言,真菌调节到微酸,细菌调节到微碱。

    培养基的种类很多,不同的微生物所需要的培养基不同。依物理性状可分为液体的、固体的和半固体的三种。固体培养基是在液体培养基中加入1.5 %~2 %的琼脂,半固体培养基是加入0.2 %~0.5 %的琼脂。琼脂(agar) 起凝固作用,一般微生物均不能分解利用。

    根据营养物质来源的不同,培养基可分为天然、半合成和合成培养基三类。天然培养基是以自然界原有的有机物为材料经灭菌后制成,如马铃薯、胡萝卜、水果、大麦粒、高粱粒等。半合成培养基中既有一些天然的有机物质,又有一些成分简单或明确的化合物。如常用的马铃薯葡萄糖培养基(PDA)、肉汁胨培养基(NA)等。合成培养基是由一些成分明确的化合物配制而成的,无任何成分不明确的物质,常用于研究微生物的生理生化性状,如查氏(Czapek)培养基等。

    根据培养基用途不同,可分为生长繁殖培养基、富集培养基、贮存培养基、选择性培养基和鉴别培养基等。在植物病理学研究中,最常用培养基有马铃薯葡萄糖培养基,主要用于分离培养病原真菌。

    在培养基配制完之后,必须经过灭菌,以便彻底杀死其中原有的一切微生物。

    3、材料、试剂与仪器

    材料 马铃薯。

    试剂 葡萄糖、琼脂等。

    仪器与用品 高压蒸汽灭菌锅、pH试纸(或酸度计)、试管、铝锅、搅拌棒、三角瓶、烧杯、漏斗、量筒、纱布、棉花、天平等。

    4、操作步骤

    PDA培养基(马铃薯葡萄糖培养基) 马铃薯(去皮)200 g 、葡萄糖20 g、琼脂15~20g、蒸馏水1000 ml ,自然pH。

    在PDA培养基配方中也可用蔗糖代替葡萄糖,这样配制的培养基也称为PSA培养基。

    (1) 称量 称量去皮马铃薯200 g,葡萄糖20 g,琼脂15~20 g。 提示:琼脂加入的量取决于琼脂的质量,质量好的15 g就够了,质量差的应适当增加。另外,在夏天气温较高时,适当增加用量。

    (2) 将马铃薯切成小块,放入锅中,加水1000 ml,煮沸30 min。用纱布滤去马铃薯残渣。

    (3) 将马铃薯滤液放回锅中,加入琼脂,加热熔化。

    提示:在琼脂熔化的过程中,需要用玻璃棒不断搅拌,并控制火力不要使培养基溢出或烧焦。

    (4) 加入葡萄糖 葡萄糖溶解后,加入适量的水以补充加热过程中损失的水分,定容至1000 ml。

    提示:通常在制作培养基的锅内用红蓝铅笔标记出不同体积的刻度,如1 000 ml、2000 ml等,在定容时直接将水加至已标记的刻度即可。

    (5) 分装 根据不同的实验目的,可将配制的培养基分装于试管内或三角瓶内。分装试管,其量为管高的1/5,灭菌后制成斜面。分装三角瓶的容量以不超过三角瓶容积之一半为宜。

    (6) 加塞 在管口或瓶口塞上棉塞。棉塞要用未脱脂的经弹松的棉花,棉塞可过滤空气,防止杂菌侵入并可减缓培养基水分的蒸发,故在植物病理学研究工作中普遍使用。

    正确的棉塞是形状、划、、松紧与管口或瓶口完全适合,过紧时妨碍空气流通,操作不便;过松则达不到滤菌的目的,且棉塞过小往往容易掉进试管内。正确的棉塞头较大,约有1/3在外,2/3在试管内。分装过程中注意不要使培养基沾染在管(瓶)口上以免浸湿棉塞,引起污染。

    (7) 包扎 加塞后,将试管用线绳捆好,再在棉塞外包一层牛皮纸,以防止灭菌时冷凝水润湿棉塞,其外再用一道线绳扎好。

    微生物的分离和培养教案

    用记号笔注明培养基名称、配制日期、组别、制作人等。

    (8) 灭菌 将上述培养基以0.1MPa,121℃,高压蒸气灭菌20 min。

    (9) 搁臵斜面 将灭菌的试管培养基竖臵冷至50℃左右(以防斜面上冷凝水太多),将试管口端搁在玻棒或其他合适高度的器具上,搁臵的斜面长度以不超过试管总长的一半为宜。

    培养基经灭菌后,必须放在37℃温箱培养24h,无菌生长者方可使用。

    PDA培养基一般不需要调pH。对于要调节pH的培养基,一般用pH试纸测定其pH。如果培养基偏酸或偏碱时,可用l mol/L NaOH或l mol/L HCl溶液进行调节。调节时应逐滴加入NaOH或HCI溶液,防止局部过酸或过碱破坏培养基成分。

    篇二:微生物的培养与分离一轮学案

    微生物的分离和培养

    【考纲要求】

    微生物的分离和培养 B 【复习要求】

    1.理解培养基对微生物的选择利用并能利用选择培养基分离微生物 2.掌握培养微生物的过程、条件和方法

    3.掌握测量微生物数量的方法、统计菌落数量的方法 4.能利用选择培养基分离微生物的方法 【基础知识】

    一、微生物的实验室培养 1.培养基

    (1)概念:人们按照微生物对营养物质的不同需求,配制出供其生长繁殖的营养基质。 (2)成分:一般都含有碳源、氮源、水和无机盐,还需满足不同微生物生长对pH、特

    1

    2

    3.实验操作

    (1)牛肉膏蛋白胨固体培养基的制备 计算→称量→熔化→灭菌→倒平板。 (2)微生物的分离方法:①划线法

    ② 平板法

    微生物的计数方法:

    二、土壤中分解尿素的细菌的分离与计数

    1.分离原理:土壤中细菌之所以能分解尿素,是由于它们体内能合成脲酶 ,这种物质在把尿素分解成无机物的过程中 起到催化作用。

    2.菌种筛选:使用_______是唯一氮源的_______培养基培养。

    3.统计菌落数目:常用方法有 、显微镜直接计数法。

    ①直接计数法:这种方法是利用血细胞计数板,在显微镜下计算一定容积里样品中微生物的数量。此法的缺点是不能区分死菌与活菌。(但用亚甲基蓝染色后,死细胞是

    3

    蓝色,活的是无色的)

    ②间接计数法(活菌计数法):稀释涂布平板法,常用来统计样品中的活菌数。此法是根据微生物在固体培养基上所形成的一个菌落是由一个单细胞繁殖而成的现象进行的。

    4.实验流程:

    土壤取样→制备培养基→微生物的培养与观察→细菌的计数。

    5.观察记录结果:每克土壤样品菌数=某稀释倍数的菌落平均数×稀释倍数。 思考:

    ①如何进行系列稀释?

    ②某稀释倍数指哪一个倍数?

    ③计算值和真实值之间的关系?为什么?

    6.鉴定方法:在培养基中加入酚红指示剂, 若pH升高,指示剂变 ,说明细菌能分解尿素。

    三、分解纤维素的微生物的分离

    1.纤维素酶:一种复合酶,它包括C1酶、Cx酶和葡萄糖苷酶,前两种酶使纤维素分解成纤维二糖,第三种酶将纤维二糖分解成葡萄糖。 2.纤维素分解菌的筛选原理

    ①刚果红可以与纤维素形成红色复合物,但并不和二糖和葡萄糖发生这种反应。 ②纤维素分解菌能产生纤维素酶分解纤维素,从而使菌落周围形成透明圈。 3. 筛选方法:

    (1) 鉴定方法: 染色法,即通过是否产生________来筛选纤维素分解菌。 (2) 筛选:以 为唯一碳源的选择培养基。 4.土壤中纤维素分解菌的筛选实验流程

    土壤取样(富含 的环境)→选择培养(用______培养基培养,目的是增加纤维素分解菌的数量)→梯度稀释→涂布平板(将样品涂布到______纤维素分解菌的培养基上)→挑选产生的菌落(产生纤维素酶的菌落周围出现 )。 【习题巩固】

    1.不同的微生物对营养物质的需要各不相同。下列有关一种以CO2为唯一碳源的自养微生物营养的描述中,不正确的是( )。 A.氮源物质为该微生物提供必要的氮素 B.碳源物质也是该微生物的能源物质

    C.无机盐是该微生物不可缺少的营养物质 D.水是该微生物的营养要素之一

    4

    2.如右图是微生物平板划线示意图。划线的顺序为1、2、3、4、5。下列操作方法正确的是( )。

    A.操作前要将接种环放在火焰旁灭菌 B.划线操作须在火焰上进行

    C.在5区域中才可以得到所需菌落

    D.在1、2、3、4、5区域中划线前后都要对接种环灭菌 3.用稀释涂布平板法测定同一土壤样品中的细菌数,在对

    6

    应稀释倍数为10的培养基中,得到以下几种统计结果,正确的是( )。 A.涂布了一个平板,统计的菌落数是230

    B.涂布了两个平板,统计的菌落数是215和260,取平均值238

    C.涂布了三个平板,统计的菌落数分别是21、212和256,取平均值163 D.涂布了三个平板,统计的菌落数分别是210、240和250,取平均值233 4.可以鉴定出分解尿素的细菌的方法是( )。 A.以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂 B.以尿素为唯一氮源的培养基中加入二苯胺试剂 C.以尿素为唯一氮源的培养基中加入苏丹Ⅲ试剂 D.以尿素为唯一氮源的培养基中加入双缩脲试剂

    5.通过选择培养基可以从混杂的微生物群体中分离出所需的微生物。在缺乏氮源的培养基上大部分微生物无法生长;在培养基中加入青霉素可以抑制细菌和放线菌;在培养基中加入10%的酚可以抑制细菌和霉菌。利用上述方法能从混杂的微生物群体中分别分离出( )。

    ①大肠杆菌 ②霉菌 ③放线菌 ④固氮细菌

    A.④②③ B.①②③ C.①③④ D.③④

    6.培养基、培养皿、接种环、实验操作者的双手、空气、牛奶所采用的灭菌或消毒方法依次是 ( )

    ①化学消毒 ②灼烧灭菌 ③干热灭菌 ④紫外线消毒 ⑤高压蒸汽灭菌 ⑥巴氏消毒法

    A.⑤③②①④⑥ B.①②③④⑤⑥C.⑥②③④①⑤D.③④②①⑥⑤ 7.下列关于微生物分离和培养的有关叙述,错误的是( ) A. 微生物培养前,需对培养基进行消毒

    B. 测定土壤样品中的细菌数目,常用菌落计数法 C. 分离土壤中不同的微生物,要采用不同的稀释度

    D. 分离能分解尿素的细菌,要以尿素作为培养基中唯一的氮源 8.用平板划线法或稀释涂布平板法纯化大肠杆菌时( )

    ①可以用相同的培养基 ②都需要使用接种针进行接种 ③都需要在火焰旁进行接种④都可以用来计数活菌 A.①② B.③④ C.①③ D.②④

    9. “筛选”是分离和培养生物新类型常用的手段,下列有关技术中不能筛选成功的是 A.在全营养的LB培养基(普通培养基)中,筛选大肠杆菌

    5

    篇三:微生物的实验室培养.(教案)

    普通高中课程标准实验教科书——生物选修1[人教版]

    课题1 微生物的实验室培养

    ★课题目标

    (一)知识与技能

    了解有关培养基的基础知识;掌握培养基的制备、高压蒸汽灭菌和平板划线法等基本操作技术

    (二)过程与方法

    分析实验思路的确定和形成的原因,分析实验流程,对比前面的实验设计,归纳共性,分析差异,增加印象

    (三)情感、态度与价值观

    形成勇于实践、严谨求实的科学态度和科学精神 ★课题重点无菌技术的操作 ★课题难点无菌技术的操作 ★教学方法启发式教学 ★教学工具 多媒体课件 ★教学过程

    (一)引入新课

    在传统发酵技术的应用中,都利用了微生物的发酵作用,其中的微生物来自于制作过程中的自然感染。而在工业化生产中,为了提高发酵的质量,需要获得优良菌种,并保持发酵菌种的纯度。这就要涉及到微生物的培养、分离、鉴别等基本技术。现在我们开始学习微生物的培养和应用专题。

    (二)进行新课 1.基础知识

    1.1 培养基的种类包括 培养基等。

    〖思考1〗琼脂是从红藻中提取的 多糖 ,在配制培养基中用作为 凝固剂 。 【补充】培养基的类型及其应用:

    1.2 培养基的化学成分包括四类营养成分。 〖思考2〗从细胞的化学元素组成来看,培养基中为什么都含有这些营养成分? C、H、O、N、P、S是构成细胞原生质的基本元素,约占原生质总量的97%以上。

    【补充】碳源:如CO2、糖类、脂肪酸等有机物,构成微生物的结构物质和分泌物,并提供能量。

    氮源:如N2、氨盐、硝酸盐、牛肉膏、蛋白胨等,主要用来合成蛋白质、核酸及含氮代谢物等。含有C、H、O、N的化合物既可以作为碳源,又可以作为氮源,如氨基酸等。

    1.3 培养基除满足微生物生长的、 和等要求。

    【补充】生长因子:某些微生物正常生长代谢过程中必须从培养基中吸收的微量有机小分子,如某些氨基酸、碱基、维生素等。

    〖思考3〗牛肉膏和蛋白胨主要为微生物提供 糖 、 维生素 和 有机氮 等营养物质。

    〖思考4〗培养乳酸杆菌时需要添加 维生素 ,培养霉菌时需要将培养基pH调节为 酸性 ,培养细菌时需要将pH调节为 中性或微碱性 。

    活动2:阅读“无菌技术”,讨论回答下列问题: 1.4 获得纯净培养物的关键是 。 1.5 无菌技术包括:

    (1)对实验操作空间、操作者的衣着和手进行 清洁和消毒 ; (2)将培养器皿、接种用具和培养基等器具进行 灭菌 ;

    (3)为避免周围微生物污染,实验操作应在 酒精灯火焰附近 旁进行; (4)避免已灭菌处理的材料用具与 周围物品 相接触。 1.6 比较消毒和灭菌(填表)

    〖思考5〗无菌技术除了防止培养物被污染外,还具有的目的是 防止感染实验操作者 。 1.7 消毒方法:

    (1)日常生活经常用到的是 煮沸 消毒法;

    (2)对一些不耐高温的液体,则使用 巴氏 消毒法(作简要介绍);

    (3)对接种室、接种箱或超净工作台首先喷洒 石炭酸或煤酚皂 等溶液以增强消毒效果,然后使用 紫外线 进行物理消毒。

    (4)实验操作者的双手使用 酒精 进行消毒; (5)饮水水源用 氯气 进行消毒。 1.8灭菌方法:

    (1)接种环、接种针、试管口等使用 灼烧 灭菌法;

    (2)玻璃器皿、金属用具等使用 干热 灭菌法,所用器械是 干热灭菌箱 ; (3)培养基、无菌水等使用 高压蒸汽 灭菌法,所用器械是 高压蒸汽灭菌锅 。 (4)表面灭菌和空气灭菌等使用 紫外线 灭菌法,所用器械是 紫外灯 。

    〖思考6〗对接种环灭菌时要用酒精灯的 充分燃烧 层火焰灼烧可能伸入试管或培养皿的部位。 〖思考7〗利用干热灭菌箱对玻璃器皿灭菌时物品不能摆得太挤,目的是避免妨碍热空气流通。

    〖思考8〗物品装入高压蒸汽灭菌锅灭菌后,要首先打开排气阀,煮沸并排除锅内冷空气,其目的是 有利于锅内温度升高 ;随后关闭排气阀继续加热,气压升至 100k Pa,温度为 121℃ ,并维持 15~30 min;最后切断热源,使温度自然降温,气压务必降至 零 时打开锅盖,其目的是防止 容器中的液体暴沸 。

    【补充】培养基的配制原则:

    ①目的要明确:根据培养的微生物种类、培养的目的等确定培养基的类型和配制量。

    ②营养要协调:培养基中各种营养物质的浓度和比例要适宜。例如:碳氮比4∶1时,谷氨酸棒状杆菌大量繁殖而产生谷氨酸少;碳氮比为3∶1时,菌体繁殖受抑制而谷氨酸合成量大增。

    ③pH要适宜:细菌培养基pH中性或偏碱性,霉菌培养基呈酸性。 2.实验操作

    2.1 计算:根据配方比例,计算100mL培养基各成分用量。

    2.2 称量:准确称取各成分。称取牛肉膏和蛋白胨时动作要迅速,目的是防止牛肉膏吸收空气中水分。 2.3 溶化:①加水加热熔化牛肉膏;②加入蛋白胨和氯化钠继续加热;③加入琼脂;④用蒸馏水定容到100mL。整个过程不断用玻棒搅拌,目的是防止琼脂糊底而导致烧杯破裂。

    2.4 调pH:用1mol/LNaOH溶液调节pH至偏碱性。

    2.5 灭菌:将配制好的培养基转移到锥形瓶中,加塞包扎后用高压蒸汽灭菌锅灭菌;所用培养皿用报纸包扎后用干热灭菌箱灭菌。

    2.6 倒平板:待培养基冷却至50℃左右时在酒精灯火焰附近操作进行。 其过程是:

    ①在火焰旁右手拿锥形瓶,左手拔出棉塞; ②右手拿锥形瓶,使锥形瓶的瓶口迅速通过火焰;

    ③左手将培养皿打开一条缝隙,右手将培养基倒入培养皿,立刻盖上皿盖。 ④待平板冷却凝固后,将平板倒过来放置。

    〖思考1〗锥形瓶的瓶口通过火焰的目的是消灭瓶口的杂菌,防止杂菌感染培养基。 〖思考2〗倒平板的目的是防止培养基冷却过程中形成的水滴落到培养基表面。 〖思考3〗若皿盖和皿底之间粘有培养基,则该平板能否培养微生物?为什么? 不能。空气中杂菌会在这些粘附培养基上繁殖,并污染皿内培养基。

    〖思考4〗配制斜面培养基中,试管要加塞棉塞的目的是保持通气并防止杂菌感染。 〖思考5〗试管培养基形成斜面的作用是增大接种面积。 2.7 接种

    2.7.1

    2.7.2平板划线法:通过接种环在琼脂固体培养基表面连续划线的操作,将聚集的菌种逐步稀释分散到培养基表面。其操作步骤是:

    ①将接种环在酒精灯火焰上灼烧直至烧红。

    ②在酒精灯火焰旁冷却接种环,并打开大肠杆菌的菌种试管的棉塞。 ③将菌种试管口通过火焰达到消灭试管口杂菌的目的。 ④将冷却的接种环伸入到菌液中取出一环菌种。 ⑤将菌种试管口再次通过火焰后塞上棉塞。

    ⑥将皿盖打开一条缝隙,把接种环伸入平板内划3~5条平行线,盖上皿盖,不要划破培养基。

    ⑦灼烧接种环,冷却后从第一区划线末端开始向第二区域内划线。重复上述过程,完成三、四、五区域内划线。注意不要将第五区的划线与第一区划线相连。

    ⑧将平板倒置放在培养箱中培养。

    〖思考6〗取菌种前灼烧接种环的目的是消灭接种环上的微生物;除第一次划线外,其余划线前都要灼烧接种环的目的是消灭接种环上残留菌种;取菌种和划线前都要求接种环冷却后进行,其目的是防止高温杀死菌种;最后灼烧接

    种环的目的是防止细菌污染环境和操作者。

    〖思考7〗在第1次划线后都从上次划线末端开始的目的是获得由单个细菌形成的标准菌落。

    2.7.3 稀释涂布平板法:将菌液进行一系列梯度稀释,并将不同稀释度菌液分别涂布到琼脂固体培养基上进行培养。当稀释倍数足够高时,即可获得单个细菌形成的标准菌落。

    2.7.4 系列稀释操作:

    ①取盛有9mL水的无菌试管6支,编号101、102、103、104、105、106。

    ②用灼烧冷却的移液管吸取1mL菌液注入编号为101试管中,并吹打3次,使之混匀。 ③从101倍液中吸取1mL菌液注入到编号为102试管内吹打均匀,获得102倍液。依此类推。 〖思考8〗操作中试管口和移液管应在离火焰1~2cm处。整个操作过程中使用了1支移液管。 3.结果分析与评价

    3.1 3.2

    3.3 培养12h和24h菌落中细菌繁殖越多,菌落体积越大;菌落的位置不动,但菌落数增多。

    〖思考9〗在某培养基上出现了3种特征不同的菌落,原因有培养基灭菌不彻底或杂菌感染等。

    〖思考10〗频繁使用的菌种利用临时保藏法保存,长期保存菌种的方法是甘油管藏法。前者利用固体斜面培养基培养后,保存在4℃冰箱中,每3~6个月转种培养一次,缺点是保存时间较短,容易发生污染和变异;后者将菌种与无菌体积等量混合后保存在-20℃冷冻箱中。

    (三)课堂总结、点评 (四)实例探究

    例1.关微生物营养物质的叙述中,正确的是

    篇四:微生物的接种、分离和培养

    实验六 微生物的接种、分离和培养

    一、目的要求

    1.理解和掌握微生物接种、分离基本技术的原理及操作要领。 2.熟悉微生物接种、分离的无菌操作过程。 3.了解微生物需氧培养的方法。

    4.学会观察和描述微生物的各种培养性状。

    二、实验原理

    1. 微生物接种

    指将微生物纯种或含菌材料转移到另一营养基质上的过程。根据不同的目的可采用的不同的接种方法,如平板划线法、斜面划线法、浸洗法、涂布法、倾注法、穿刺法、点植法和影印法。

    2. 微生物分离

    指依据微生物的特征,采用各种方法从含菌样品中获得由单一个体(如单一菌体或孢子)或一段菌丝生长繁殖形成的微生物群体的过程。常用的分离方法有:平板划线法、稀释涂布平板分离法、稀释倾注平板分离法和单细胞分离法。

    平板分离法的基本原理包括两个方面:

    (1)选择适合于待分离微生物的生长条件,如营养、酸碱度、温度和氧等要求或加入某

    种抑制剂造成只利于该微生物生长,而抑制其他微生物生长的环境,从而淘汰一些不需要的 微生物。

    (2)微生物在固体培养基上生长形成的单个菌落可以是由一个细胞繁殖而成的集合体。 因此可通过挑取单菌落而获得一种纯培养。

    值得指出的是从微生物群体中经分离生长在平板上的单个菌落并不一定保证是纯培养。 因此,纯培养的确定除观察其菌落特征外,还要结合显微镜检测个体形态特征后才能确定, 有些微生物的纯培养要经过一系列的分离与纯化过程和多种特征鉴定方能得到。

    3. 微生物培养

    指微生物被接种到营养基质后,在一定条件下生长繁殖的过程,分需氧培养法和厌氧培养法。本实验所做的需氧培养法,是采用生化培养箱和恒温摇床进行的。

    4. 微生物的培养形状

    培养性状是微生物在培养基上所表现的群体形态和生长情况。平板菌落特征、斜面和液体培养特征、半固体穿刺培养特征等培养性状,是鉴定微生物的重要形态学依据。

    菌落是由单个或少数细胞在固体培养基表面或里面生长繁殖所形成的内眼可见的子细胞群体。菌落形态会因菌种不同或菌种相同但所用培养基、培养温度和时间等条件不同而存在不同程度的差异。若所用培养基、培养温度和时间等条件相同,则同一种菌所形成的菌落形态具有相对的稳定性和专一性。

    三、实验材料

    1. 菌种 大肠杆菌(Escherichia coli),枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis),金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus),啤酒酵母(Saccharomyces cerevisiae),热带假丝酵母(Candida tropicalis),毛霉(Mucor sp.),根霉(Rhizopus sp.),黑曲霉(A.niger),青霉(Penicillium sp.),混合菌液。

    2. 培养基 营养琼脂斜面和平板,半固体营养琼脂直立柱,PDA 斜面和平板。 3. 接种工具 接种环,接种针,涂布棒,无菌吸管等。 4. 其他 酒精灯,生化培养箱等。

    四、实验方法与步骤 (一)实验项目

    接种前的准备:接种的试管、培养皿等应做好标记,注明菌种的名称,日期、接种者等。

    表6-1实验项目

    (二)各种接种方法的操作步骤

    所有待接种的培养基在接种前都要先贴好标签,整个接种过程都必须在酒精灯旁进行。 1.斜面接种

    斜面接种是从已生长好的菌种斜面上挑取少量菌种移植至另一支新鲜斜面培养基上的一种接种方法。具体操作如下:

    (1)操作前,先用75%酒精擦手,待酒精挥发后才能点燃酒精灯。

    (2)用斜面进行接种时,将原菌种管和待转接斜面试管夹在左手的大拇指和其它四指之间,斜面朝上,并处于水平位置。(图6-1,1)

    1 23

    45 6

    图6-1 斜面划线接种示意图

    (3)先将原菌种管和待转接斜面试管的硅胶塞旋转一下,以便接种时便于拔出。 (4)右手拿接种环(与日常拿笔一样)在火焰上将环金属丝部分烧红灭菌,然后将其

    余要伸入试管部分的金属柄也反复通过火焰灭菌。(图6-1,2)

    (5)用右手小指、无名指或手掌将原菌种管和待转接斜面试管的硅胶塞同时拔出并把硅胶塞握住,不得任意放在桌上或与其它物品相接触,再以火焰烧管口(图6-1,3)。

    (6)将上述在火焰上灭菌过的接种环伸入菌种管内,接种环在接触菌种前先在试管内壁上或未长菌落的培养基面上接触一下,使接种环充分冷却,以免烫死菌种,然后用接种环轻轻沾取少量菌苔,接着将接种环自菌种管内抽出。抽出时勿与管壁相碰,也勿通过火焰(图6-1,4)。

    (7)迅速将沾有菌种的接种环伸入待接斜面试管中,自斜面培养基底部向上划线,使菌体沾附在培养基的斜面上,划线时环要平放,勿用力,否则会使培养基表面划破(图6-1,5)

    (8)接种完毕后将接种环抽出,灼烧一下管口,塞上硅胶塞,塞棉塞时勿要用试管口去迎棉塞,以免试管在移动时纳入不洁空气。(图6-1,6)。

    (9)接种环放回原处前要在火焰上彻底灭菌,接种致病菌时更要注意这点。将棉塞旋紧。注意:棉塞与火焰的距离要适当,以免棉塞燃烧。

    2.穿刺接种

    (1) 操作方法见图6-2,可以水平穿刺,也可以垂直穿刺,所使用的接种针要笔直。 (2) 将接种针自培养基中心刺入,直到接近管底,但勿穿透,然后沿原穿刺途径慢慢拔出。

    图6-2 穿刺接种示意图

    3.平板接种

    (1)划线接种 见分离划线法。

    (2)涂布接种 用无菌吸管吸却菌液注入平板后,用灭菌的玻璃在平板表面作均匀涂布 (图7-3)。

    (3)三点接种法

    ① 标明三点位置:欲使点接的三点分布均匀,可用记号笔先在平板底部以等边三角形状标上三点。

    ② 取接种针:拿接种针,先在火焰上烧红灭菌,并在平板培养基的边缘冷却且蘸湿。 ③ 沾取孢子:将灭过菌并蘸湿的接种针伸入菌种管,用针尖沾取少量霉菌孢子。 ④

    点接:操作方法基本同穿刺接种,以垂直法或水平法把接种针上沾着的孢子以垂直

    的方向轻轻的点接到平板培养基表面预先做好标记的部位。注意在点接时切勿刺破培养基。

    4.分离方法 (1)涂布平板分离法

    涂布平板分离法是样品经过适当稀释后,用无菌吸管吸取0.1mL于固体培养基平板中,用无菌玻璃涂棒将稀释液均匀地涂布,使样品中的菌体经过培养后能在平板表面上形成单个菌落。(图6-3)

    (2)稀释倾注平板分离法

    倾注平板分离法是最常用的纯种分离法,先将待分离的材料作一系列的稀释(如1:10,1:100,1:1000,1:10,000……),然后分别取不同稀释液少许(一般取0.1mL),与已熔化并冷却至45℃的琼脂培养基相混合,摇匀后,倾入灭过菌的培养皿中,待琼脂凝固后,保温培养一定时间即可出现菌落.如果稀释得当,平皿上就可出现分散的单个菌落,这个菌落可能就是由一个细胞繁殖形成的.随后挑取该单个菌落,或重复以上操作数次,便可得到纯培养。(图6-4)

    (3)平板划线分离法

    划线的方法很多,但无论采用哪种方法,其目的都是通过划线将样品在平板上进行稀释,使之形成单个菌落。常用的划线方法有下列二种:

    用接种环以无菌操作挑取菌悬液一环,先在平板培养基的一边作第一次平行划线1~2 条,再转动培养皿约70°角,并将接种环上剩余物烧掉,待冷却后通过第一次划线部分作第二次平行划线,再用同样的方法通过第二次划线部分作第三次划线和通过第三次平行划线部分作第四次平行划线。划线完毕后,盖上培养皿盖,倒置于温室培养。(图6-5)

    将挑取有样品的接种环在平板培养基上作连续划线。划线完毕后,盖上培养皿盖,倒置于温室培养。

    图6-3 稀释涂布平板分离法

    篇五:微生物的分离与培养

    微生物的分离与培养

    实验原理:

    一、 培养基的制备

    培养基通过人工加入微生物的生长所必需的各种成分,包括水,碳源,单元,无机盐和生长因子各种营养物质配置而成的养料。

    二、 微生物的接种

    微生物接种技术是生物科学研究中最基本的操作技术。由于实验目的,培养基种类及容器等不同,所以接种方法不同。用不同的接种方法以获得生长良好的纯种微生物。

    三、 微生物的培养

    不同的微生物对营养需求不同,根据这点可以通过培养基对微生物的做初步分离。

    四、 质粒的提取

    碱变性提取质粒DNA是基于染色体DNA和质粒DNA的变性与复性的差异而达到分离目的的。在PH值高达12.6的碱性条件下,染色体DNA的氢键断链,双螺旋结构解开而变性,质粒DNA的大部分氢键也断链,但超螺旋共价闭合环状的两条互补链不会完全分离,当以PH4.8D的NaAc高盐缓冲液冲击去调节其PH值至中性时,变性的质粒DNA又恢复原来的构型,保存在溶液中,而染色体DNA不能复性而形成缠连的网状结构,通过离心,染色体DNA与不稳定的大分子RNA,蛋白质—SDS的复合物等一起沉淀下来而被除去。

    五、 PCR技术

    DNA的半保留复制时生物进化和传代的重要途径。双链DNA在多种酶的作用下可以变性解旋或单链。在DNA聚合酶的参与下,根据碱基互补配对原则复制或同样的两分子拷贝。在实验中发现,DNA在高温时也可以发生变性解链,当温度降低后可以复性成为双链。因此,通过温度变化控制DNA的变性和复性,加入设计引物,DNA聚合酶,dNTP就可以完成特定基因的体外复制。

    六、 琼脂糖凝胶电泳

    许多重要的生物,如蛋白质,核酸等都具有可电离的基因,在某一特定的PH下他们可以电离正电荷或负电荷,当加上电均后,这些带点分子就会向着与其所带电荷极性相反的电极方向移动。而电泳技术就是利用在电均的作用下,由于待分离样品中各种分子带点性质,分子大小形状等的差异,从而产生不同的迁就率,对样品进行分离,鉴定或纯化的技术。 PCR产物的回收 将含有质粒DNA的荧光色带切下,溶解后填充到硅胶柱中,利用硅胶在高盐低PH下吸附DNA,在低盐和高PH条件下DNA可在被洗脱的原理,进行DNA的回收和纯化。

    七、 酶切

    限制性核酸内切酶是一类能识别双链DNA中特定碱基顺序的核酸水解酶(水解磷酸二酯键)。

    八、 重叠延伸PCR技术(引物摒接PCR)

    重叠延伸PCR技术由于采用有互补末端的引物,使PCR产物形成了重叠链,从而在随后的扩增反应中通过重叠链的延伸,将不同来源的扩增片段重叠摒接起来,重叠PCR技术关键是重叠互补引物的设计,重叠延伸PCR在基因的定点突变,融合基因的构建,长片段基因的合成,基因敲除以及目的基因的扩增方面有其广泛而特殊的应用。 实验流程

    1:培养基的制备

    1.1 药品的称量:在电子天平上按照配方称取蛋白胨(5g)NaCl(2.5g)牛肉膏(1.5g)琼脂(4g)

    1.2 溶解加热与调解PH值:水浴加热至溶解,并用纯水定容至500ml,滴加1mol/L的NaOH滴定PH值为7.0~7.5

    1.3 分装与灭菌:对三角烧瓶分别编号为A、B并依次加入250ml培养液,在B中加入预先称好的4g琼脂

    1.4 固体培养基抗性的加入与倒平板:按照1/1000的剂量在三角烧瓶B中加入

    2.5μl的卡那霉素,摇匀后打开培养皿倒入较小的培养皿

    ? 备注:为防止培养基在凝固过程中冷凝水回流造成培养基污染,注意培养皿

    放置时上下面问题。同时,所有操作均在酒精灯附完成。

    2:大肠杆菌的接种与培养

    2.1微生物的接种:将完成灭菌的接种针沾取适

    量菌液,在已经凝固的培养基上如图3.2进行平

    板划线,注意:划线目的是在于将菌液转移到培

    养基上

    2.2微生物的培养:将完成接种培养基放入设定

    温度为37℃的生化培养箱中过夜培养

    ? 备注:抗生素拥有半衰期,注意在半衰期中

    完成培养。同时所有操作均在酒精灯附完成。

    三角烧瓶等仪器打开和关闭时注意瓶口通过火焰。

    3:质粒的提取

    3.1试剂盒的准备:将RNA酶加入S1中,去80ml无水乙醇加入到W2中

    3.2质粒提取:去2ml菌液于2ml的离心管中,8000rpm/min离心2min,弃上清液,重复以上操作一次,保证细菌沉积量。加入250μl S1充分摇匀,使细菌悬浮。对准管壁,打入250μl S2,为防止基因组和质粒一起被提取出来,温和翻转5次,静置1min。加入约350μl S3,充分混匀后冰上放置约10min。12000rmp/min 离心10min,并将上清液转移至制备管中静置1min。12000rmp/min 离心1min,弃滤液。在制备管中央打入500μl W1,12000rmp/min 离心1min,弃滤液。加入700μl W2,12000rmp/min 离心1min,重复2次。弃滤液后12000rmp/min 离心空甩1min,去除残余W2.制备管中央打入100μl Elunt 静置1min,12000rmp/min 离心1min,洗脱质粒。

    ? 备注:试剂盒完成准备后要在相应的试剂瓶上做上规定标记。提取时时刻记

    住相应的操作时留清液还是留沉淀。操作时注意试剂加入的顺序和剂量。离心时转速和时间的设定可以按照高转速少时间的原则灵活调整。

    4:PCR技术(聚合酶链式反应)

    4.1 PCR反应体系(50μl)的构建:质粒(1μl)、Buffer缓冲液(5μl)、pfu DNA聚合酶(0.5μl)、dNTP(3μl)引物(1+1μl)、剩下的用H2O2补足到50μl

    4.2 PCR反应体系中各成分的作用:质粒提供目的基因即模板,Buffer缓冲液提供稳定的缓冲体系,pfu DNA聚合酶可以修复碱基之间的磷酸二酯键,dNTP提供4种碱基,引物可以控制复制的开始。

    4.3 PCR仪程序的设定:预变性(96℃ 5min)→[变性(95℃ 30s)→引物退火(58℃ 30s)→引物延伸(72℃ 1min)循环30次]→最后延伸(72℃ 2min) ? 备注:加入试剂是注意确保试剂的全部加入,使用前检查PCR程序的设定,

    PCR仪显示开始工作后不可以在加入待扩增的基因。PCR

    仪工作时不建议打

    开盖子。

    5:琼脂糖凝胶电泳提纯目的基因

    5.1 制胶:分别称取4.5g琼脂,用纯水定容至300ml,加入三角烧瓶中并编号A/B,水浴加热至溶解,A瓶中加入适量核酸染料。分别倒入两个电解槽中,插入梳子待琼脂凝固

    5.2 跑电泳(PCR产物电泳):在PCR产物中加入2μl溴酚蓝染液,摇匀。在A胶的第一个孔中加入6μl的Marker,后面的孔中每孔加入10μl产物——溴酚蓝复合物。放入电泳槽中电泳

    5.3 跑电泳(质粒):在溴酚蓝中加入适量

    核酸染料,形成溴酚蓝——核酸染料复合

    物,在B胶第一个孔中同样加入6μl的

    Marker,取3μl质粒和1μl溴酚蓝——核酸

    染料复合物充分摇匀后加入后面的孔中。

    放入电泳槽中电泳

    ? 备注:在制胶时注意电解槽的密封。取

    胶时注意动作轻柔,防止胶被拉坏。点样时注意枪头不要讲凝胶捅破。电泳时注意正负极,凝胶在电泳槽中不要倾斜放置

    6:PCR产物的回收

    6.1 回收PCR目的产物实验:取500μl的溶胶剂和适量胶块于2ml离心管中,65℃水浴加热至溶解。将液体转移到硅胶柱中,静置1min后8000rpm离心1min。下层滤液倒回硅胶柱中静置1min后8000rpm重复离心1min。加入500μl W2 8000rpm离心30s,弃滤液。重复加入500μl W2 12000rmp 离心30s。将硅胶柱放入1.5ml离心管中,加入DI 100ml静置1min。12000rmp离心1min 下层滤液中含有产物

    ? 备注:溶胶时注意胶体的完全溶解

    7:酶切

    7.1质粒的酶切实验:在1.5ml离心管中分别加入DI(14μl)、酶切缓冲液(2μl)、质粒(2μl)、EcoR I(1μl)、Swa I(1μl)后轻轻混匀,1000rpm离心10s。37℃水浴加热30min后温度改为65℃水浴10min。1000rpm离心10s。取10μl与10x缓冲液混匀,电泳检测

    ? 备注:加入的为DI去离子水,酶需要放到冰箱中低温保存,使用时任何高

    温物体严禁靠近装有酶的试剂管。加酶时注意及时更换移液枪枪头。 9:重叠延伸PCR技术(引物摒接PCR)

    9.1构建扩增体系A:Mix(10μl)、Pfu DNA聚合酶(1μl)、DNTP(3μl)、10x Buffer(5μl)、Add水(补足总体积至50μl)

    9.2构建扩增体系B:上轮PCR产物(3μl)、Pfu DNA聚合酶(1μl)、DNTP(3μl)、10x Buffer(5μl)、首尾引物(1+1μl)Add水(补足总体积至50μl)

    9.3程序设定:扩增体系A扩增,扩增产物为完整模板,在将模板加入扩增体系B进行扩增

    ? 备注:不可以使用TapDNA聚合酶

    实验结果

    培养基的制备

    大肠杆菌的接种与培养

    质粒的提取

    PCR技术(聚合酶链式反应)

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